Introduzione

L’invenzione consiste in una proteasi ingegnerizzata, chiamata unica-TEV, la cui attività proteolitica altamente specifica è chimicamente inducibile dallo sperimentatore in diversi compartimenti subcellulari.
Unica-TEV, quando espressa in cellule vitali, permette di controllare: i) maturazione di proteine; ii) vie di segnale intracellulari; iii) espressione genica.
Unica-TEV può essere usata anche per la purificazione di proteine ricombinanti.

Caratteristiche Tecniche

Unica-TEV è ottenuta dall’inserzione di un dominio regolatore artificiale all’interno della catena amminoacidica della proteasi e supera gli svantaggi dei sistemi a tutt’oggi noti. La strategia utilizzata consente, infatti, di realizzare una proteasi inducibile, avente una singola catena peptidica. Questa soluzione rende unica-TEV non più soggetta a stechiometria variabile come, invece, avviene negli approcci finora utilizzati basati su protein complementation assay (PCA). Con unica-TEV, quindi, la risposta proteolitica è molto meno eterogenea e l’attività di background ridotta. Unica-TEV è in grado di raggiungere substrati localizzati in compartimenti subcellulari, risultato difficile da ottenere con un approccio basato su PCA. Unica-TEV è in grado di tagliare qualsiasi proteina in cui viene inserito il sito di riconoscimento di TEV (TEVcs, 6 aminoacidi). L’inserimento di TEVcs nella sequenza di proBDNF, mediante sostituzione del sito di riconoscimento della furina/plasmina, assicura la maturazione del BNDF sotto il controllo dello sperimentatore, attraverso l’uso di unica-TEV, e la svincola dalla regolazione operata dalle proteasi endogene. Unica-TEV può essere utilizzata anche per controllare l’espressione genica.

Possibili Applicazioni

• Controllo dell’attività proteolitica in cellule vitali;
• Controllo dell’espressione genica;
• Controllo della maturazione di pro-proteine;
• Controllo di vie di segnalazione intracellulari;
• Purificazione di proteine;
• Rimozione di Tag di affinità;
• Applicazioni terapeutiche;
• Approcci biotecnologici innovativi.

Vantaggi

• Elevata specificità di sequenza;
• Singola catena peptidica;
• Alta tollerabilità cellulare;
• Attività indipendente da pH;
• Indipendenza da co-fattori e secondi messaggeri;
• Completo controllo di attività;
• Bassa attività Background;
• Stechiometria non variabile;
• Attività in compartimenti subcellulari.