Il microscopio STED si basa sull'utilizzo di luce pulsata per eccitare il campione da analizzare, con una secondo fascio (chiamato STED) di luce che produce una emissione stimolata degli atomi eccitati, facendo perdere loro energia. Quest'ultimo è in forma di "ciambella", ottenendo così una deplezione solo degli atomi esterni, aumentando la risoluzione dell'immagine e superando il limite di diffrazione dei microscopi convenzionali. Tuttavia, la risoluzione spaziale nella maggior parte dei casi è limitata dalla potenza massima "tollerata" dal campione a causa di effetti foto-dannosi indotti dall'illuminazione con il fascio STED.

Per il motivo sopracitato è stata sviluppata una strategia per aumentare la risoluzione spaziale senza aumentare l'intensità del fascio STED: il metodo della presente invenzione è basato sulla modulazione lenta dell'intensità del fascio STED e l'analisi delle dinamiche indotte comporta una semplificazione generale della procedura e può essere integrato in qualsiasi microscopio STED. La modulazione lenta insieme alla forma a "ciambella" permette di aumentare la risoluzione spaziale senza aumentare l'intensità del fascio STED, evitando così di danneggiare il campione. La modulazione della fluorescenza alla periferia del volume di osservazione viene eseguita su una scala temporale arbitraria, per cui non è necessario utilizzare un fascio di eccitazione pulsata. Ciò comporta il vantaggio di poter utilizzare sorgenti luminose come ad esempio il laser, che sono economiche rispetto a quelle necessarie per un'eccitazione pulsata di altre tecniche.

• Studio di architetture e dinamiche sub-cellulari sfruttando la risposta non lineare dei fluorofori comunemente utilizzati per la marcatura di campioni biologici

• Risoluzione spaziale migliore senza aumentare l'intensità del fascio STED
• Modulazione della fluorescenza su scala temporale arbitraria, quindi le tecniche di eccitazione pulsata non sono necessarie
• Utilizzo di sorgenti luminose come ad esempio il laser, che sono economiche rispetto a quelle necessarie per un'eccitazione pulsata
• Utilizzo di un rilevamento elettronico semplice ed economico, poiché non è necessario rilevare la dinamica della fluorescenza in nanosecondi