Introduzione

La microscopia confocale a scansione laser (CLSM) con fluorescenza consente l’imaging tridimensionale simultaneo, l’imaging profondo, l’imaging di cellule vive e l’imaging quantitativo di un bersaglio biologico. Prima dell’imaging, i bersagli vengono colorati con vari coloranti fluorescenti, utilizzati anche come etichette durante l’imaging a fluorescenza multispecie. Convenzionalmente, l’imaging CLSM multi-specie simultaneo viene eseguito isolando il segnale fluorescente risultante dal raggio di eccitazione e immergendolo in una serie di componenti spettrali utilizzando una combinazione di filtri, specchi dicroici e/o filtri acusto-ottici regolabili. Viene quindi utilizzato un rivelatore per registrare ciascuna banda spettrale. Questa tecnica, tuttavia, presenta un paio di inconvenienti poiché il numero di rivelatori richiesti aumenta con il numero di sonde e il cross-talk tra gli spettri di emissione di diverse sonde degrada la qualità dell’immagine.

Caratteristiche Tecniche

È stato sviluppato un microscopio a fluorescenza multispecie per illuminare un campione con una pluralità di fasci di luce di eccitazione pulsata comprendenti diverse componenti spettrali di eccitazione. Il microscopio è costituito da i) un rilevatore a singolo fotone configurato per rilevare un segnale di fluorescenza emesso da un campione, ii) un segnale di fluorescenza comprendente diverse componenti spettrali, iii) un codificatore dello spettro di eccitazione configurato per imporre un rispettivo ritardo temporale su ciascuna componente spettrale di eccitazione , iv) un codificatore dello spettro di emissione che può imporre un rispettivo ritardo temporale su ciascuna componente spettrale di emissione, e v) un decodificatore multispecie configurato per decodificare lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la curva di decadimento della fluorescenza per le specie fluorescenti contenute nel campione analizzato.

Possibili Applicazioni

• Imaging biologico;
• Applicazioni di microscopia laser.

Vantaggi

• Compatibile con gli attuali sistemi CLSM;
• Compatibile con gli approcci ISM;
• Consente l’esplorazione completa delle tre principali firme della sonda da sole e in combinazione al fine di ottenere l’imaging multi-specie in modo scalabile e semplice;
• Compatibile con noti algoritmi di un-mixing spettrale, deconvoluzione, fasore, adattamento e apprendimento automatico.