Introduzione

Il microscopio STED (Stimulated Emission Depletion) permette di ottenere l’immagine di un campione biologico decomponendo virtualmente quest’ultimo in regioni da cui registrare un segnale ottico. Ricomponendo tutti i segnali dalle diverse regioni è possibille ricostruire un immagine molto-dettagliata (in super-risoluzione) del campione.  Ogni segnale ottico comprende una componente principale emessa dai marcatori presenti nella regione in questione ed eccitati da un primo fascio luminoso e una componente spuria (rumore di fondo), emessi da altri marcatori delle stessa specie chimiche ma eccitati indesiderabilmente da un secondo fascio di luce. A tal fine, il metodo secondo la presente invenzione si avvale di un sistema di rilevamento sincrono per stimare in modo affidabile, e successivamente eliminare, il rumore di fondo indesiderato generato dall’eccitazione diretta della specie fluorescente con il secondo fascio luminoso (chiamato fascio STED).

Caratteristiche Tecniche

Il rilevamento sincrono viene eseguito pixel per pixel, con l’interruzione periodica del fascio di eccitazione. Quest’interruzione può essere ottenuta utilizzando le caratteristiche di modulazione della sorgente laser che genera il fascio di luce, o dispositivi esterni come modulatori acusto-ottici (AOM), otturatori meccanici veloci, modulatori elettro-ottici (EOM) o filtri regolabili acusto-ottici (AOTF). Il segnale ottico ricevuto dal campione viene quindi rilevato in modo sincrono con la temporizzazione del fascio di eccitazione e viene quindi utilizzato per la stima del rumore di fondo. Grazie ad una modulazione veloce del fascio di eccitazone, tutte le fluttuazioni indesiderate del segnale, come il fotobleaching delle specie chimiche fluorescenti o lo spostamento del campione, vengono minizzate, ottenendo quindi una stima veritiera del rumore. La presente invenzione può essere applicata a qualsiasi microscopio STED esistente, indipendentemente dal tipo di sorgente di eccitazione e dalla sorgente STED. Nel caso di laser pulsati, la frequenza di interruzione del fascio di eccitazione deve essere scelta tenendo conto dell’intervallo di impulso del fascio di eccitazione; in particolare, deve essere scelto in modo da essere molto inferiore alla frequenza di impulso del fascio di eccitazione. TRL 4

Possibili Applicazioni

• Metodi di imaging e più specificamente metodi di microscopia ad alta risoluzione e velocità in grado di risolvere i dettagli al di sotto del limite di diffrazione di Abbe
• Studio di architetture e dinamiche subcellulari sfruttando la risposta non lineare dei fluorofori comunemente usati per la marcatura di campioni biologici

Vantaggi

• Rumore di fondo considerabilmente ridotto
• I rischi associati ai tempi morti dell’apparecchio di rilevamento notevolmente ridotti
• Metodo applicabile in tutte le configurazioni di microscopia STED